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发布日期:2020-03-01

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  12生物工程(2)班合 肥 学 院 HEFEI UNIVERSITY 题 目: PCR技术论文 系 别: 生物与环境工程系专 业:_ 12生物工程2班 学 号: 1202012043 姓 名: 乐一鹏 指导教师: 阚劲松 时间: 2014年11月27日 12生物工程(2)班 PCR技术论文 摘要:PCR技术又称无细胞分子克隆系统或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增法, 是体外酶促合成特异 DNA片段的一种方法,由高温变性、低温退火及适温延伸等几步 反应组成一个周期 ,循环进行,使目的 DNA 得以迅速扩增,具有特异性强、灵敏度高、 操作简便、省时等特点 ,是基因扩增技术的一次重大革新。PCR技术可将极微量的靶DNA 特异地扩增上百万倍,从而大大提高对DNA分子的分析和检测能力,能检测单分子DNA或 对每10万个细胞中仅含1个靶DNA分子的样品,因而此方法立即在分子生物学、微生物学、 医学及遗传学等多领域广泛应用和迅速发展。 关键词:PCR原理、PCR过程及应用、技术论文关于PCR技术要点 1、PCR 技术的基本原理 DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链 DNA 在多种酶的作用下可 以变性解链成单链,在 DNA 聚合酶与启动子的参与下,根据碱基互补配对原则复制成 同样的两分子挎贝。在 实验中发现,DNA 在高温时也可以发生变性解链,当温度降低 后又可以复性成为双链。因此,通过温度变化控制 DNA 的变性和复性,并设计引物做 启动子,技术论文加入 DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。 PCR的过程类似于 DNA的天然复制过程,其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡 核苷酸引物。PCR由变性--退火(复性)--延伸三个基本反应步骤构成: ①模板 DNA 的变性:模板 DNA经加热至 93℃左右维持一定时间,使含有所需扩增分析序列的靶 DNA双链经热变性处理解开为两个寡聚核苷酸单链,然后加入一对根据已知 DNA 序列 由人工合成的与所扩增的 DNA两端邻近序列互补的寡聚核苷酸片段作为引物,即左右 引物。此引物范围就在包括所欲扩增的 DNA 片段,一般需 20-30 个碱基对,过少则难 保持与 DNA 单链的结合;②模板 DNA 与引物的退火(复性):模板 DNA 经加热变性成单 链后,温度降至 55℃左右,引物与模板 DNA 单链的互补序列配对结合; ③引物的延 伸:DNA模板--引物结合物在 TaqDNA 聚合酶的作用下,于 72℃左右,以 4 种三磷酸 脱氧核苷(dNTP)为反应原料,靶序列为模板,按碱基配对与半保留复制原理, 按 5 到 3 方向将引物延伸、自动合成新的 DNA 链、使 DNA 重新复制成双链。重复循环 变性--退火--延伸三过程,就可获得更多的 “半保留复制链” , 每次循环延伸的模板 又增加 1倍,亦即扩增 DNA 产物增加 1 倍,经反复循环,使靶 DNA 片段指数性扩增。 每完成一个循环需 2~4分钟,2~3 小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍 。 2、PCR 技术的反应体系与反应条件 (一)标准的PCR反应体系:10×扩增缓冲液 10ul4种dNTP混合物 各200umol/L引物 各10~100pmol 模板DNA 0.1~2ug Taq DNA聚合酶 2.5u 12生物工程(2)班Mg 2+1.5mmol/L加双或三蒸水至 100ul (二)PCR反应五要素: 参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和 Mg 2+ (1)引物: 引物是PCR特异性反应的关键,PCR 产物的特异性取决于引物与模板 DNA互补的程度。理论上,只要知道任何一段模板DNA序列,就能按其设计互补的寡核苷 酸链做引物,利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。 设计引物应遵循以下原则:①引物长度: 15-30bp,常用为20bp左右。②引物扩增跨度: 以200-500bp为宜,特定条件下可扩增长至10kb的片段。③引物碱基:G+C含量以40-60%为宜,G+C太少扩增效果不佳,G+C过多易出现非特异 条带。ATGC最好随机分布,避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。④避免引物内部出现二级结构,避免两条引物间互补,特别是3’端的互补,否则会 形成引物二聚体,产生非特异的扩增条带。⑤引物3’端的碱基,特别是最末及倒数第二个碱基,应严格要求配对,以避免因末 端碱基不配对而导致PCR失败。技术论文⑥引物中有或能加上合适的酶切位点,被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点,这对 酶切分析或分子 克隆很有好处。 ⑦引物的特异性:引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。 ⑧引物量: 每条引物的浓度0.1~1umol或10~100pmol,以最低引物量产生所需要 的结果为好,引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增,且可增加引物之间形成二聚体的 机会。 (2)酶及其浓度。目前有两种Taq DNA聚合酶供应, 一种是从栖热水生杆菌中提纯 的天然酶,另一种为大肠菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反应约需酶量2。5U(指 总反应体积为100ul时),浓度过高可引起非特异性扩增,浓度过低则合成产物量减少。 (3)dNTP的质量与浓度。dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系,dNTP粉呈 颗粒状,如保存不当易变性失去生物学活性。dNTP溶液呈酸性,使用时应配成高浓度后, 以1M NaOH或1M Tris。HCL的缓冲液将其PH调节到7.0~7.5,小量分装, -20℃冰冻保 存。多次冻融会使dNTP降解。在PCR反应中,dNTP应为50~200umol/L,尤其是注意4 种dNTP的浓度要相等( 等摩尔配制),如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低), 就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量。dNTP能与Mg 2+ 结合,使游离的Mg 2+ 浓 度降低。 (4)模板(靶基因)核酸。模板核酸的量与纯化程度,是PCR成败与否的关键环节之 一,传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本。SDS的主要功能是: 溶解细胞膜上的脂类与蛋白质,因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜,并解离细胞中的核蛋白, SDS 还能与蛋白质结合而沉淀;蛋白酶K能水解消化蛋白质,特别是与DNA结合的组蛋白, 再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份,用乙醇或异丙醇沉淀核酸。提取的 核酸即可作为模板用于PCR反应。一般临床检测标本,可采用快速简便的方法溶解细胞,

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